l 本试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中小鼠1,25-二羟基维生素D3(1,25(OH)2D3)的含量。 l 有效期:6个月 l 保存条件:2-8℃ 实验原理 试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被小鼠1,25-二羟基维生素D3(1,25(OH)2D3)捕获抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成*终的黄色。颜色的深浅和样品中的小鼠1,25-二羟基维生素D3(1,25(OH)2D3)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品浓度。 样本处理及要求 1. 血清:将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜,然后1000×g离心20 分钟,取上清即可,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。 2. 血浆:用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本,并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。 3. 组织匀浆:用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织,去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果),称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比,比如1g的组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融。*后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟,取上清检测。 4. 细胞培养物上清或其它生物标本:请1000×g离心20分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。 注:标本溶血会影响*后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。 需要而未提供的试剂和器材 1. 酶标仪(450nm) 2. 高精度加样器及枪头:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL 3. 37℃恒温箱 4. 蒸馏水或去离子水 试剂盒组成 名称 | 96孔配置 | 48孔配置 | 备注 | 微孔酶标板 | 8孔×12条 | 8孔×6条 | 无 | 标准品 | 0.3mL*6管 | 0.3mL*6管 | 无 | 样本稀释液 | 6mL | 3mL | 无 | 检测抗体-HRP | 10mL | 5mL | 无 | 20×洗涤缓冲液 | 25mL | 15mL | 按说明书进行稀释 | 底物A | 6mL | 3mL | 无 | 底物B | 6mL | 3mL | 无 | 终止液 | 6mL | 3mL | 无 | 封板膜 | 2张 | 2张 | 无 | 说明书 | 1份 | 1份 | 无 | 自封袋 | 1个 | 1个 | 无 | 备注: 1. 标准品浓度依次为:48、24、12、6、3、1.5 ng/mL 2. 经过大量正常标本检验,标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内,实验过程中直接取50μL样本上样即可。当有部分样本值超过标准品浓度时,可用样本稀释液将标本进行适当稀释后再进行实验。 注意事项 1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。 2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。 3. 消除板底残留的液体和手指印,否则影响OD值。 4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色,已经变蓝的底物液不能使用。 5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。 6. 在储存和温育时避免强光直接照射。 7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。 8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。 9. 不能使用过期产品。 10. 如果可能传播疾病,所有的样品都应管理好,按照规定的程序处理样品和检测装置。 试剂准备 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。 20×洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按1:20稀释,即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。 操作步骤 1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。 2. 设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL; 3. 样本孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品*终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。;空白孔不加。 4. 除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。(空白孔不加HRP。) 5. 弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液(350μL),静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。 6. 每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。 7. 每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。 实验结果计算 以所测标准品的OD值为横坐标,标准品的浓度值为纵坐标,在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线,并得到直线回归方程,将样品的OD值代入方程,计算出样品的浓度。 试剂盒性能 1. 检测范围:1.5 ng/mL – 48 ng/mL。 2. 灵敏度:检测浓度小于0.1 ng/mL。 3. 特异性:不与其它可溶性结构类似物交叉反应。 4. 重复性:板内变异系数小于10% ,板间变异系数小于15% 。 原创作者:上海瓦兰生物科技有限公司 |