| 本试剂盒仅供科研使用 漆酶（Laccase）试剂盒说明书 （货号：WS1450F 分光法 48 样） 一、产品简介： 漆酶（EC 1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶家族，广泛分布于真菌 和高等植物中，具有较强的氧化还原能力，在纸浆生物漂白，环境污染物降解和木质纤维 素降解以及生物检测方面有非常广泛的应用。 漆酶分解底物 ABTS 产生 ABTS 自由基，在 420nm 处的吸光系数远大于底物 ABTS， 测定 ABTS 自由基的增加速率，可计算得漆酶活性。 二、试剂盒组分与配制 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 28mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂×1 瓶 4℃保存 临用甩几下，使粉剂落到底部， 再加 12mL 蒸馏水充分溶解，4℃ 保存一周，若变色则不能使用。 三、所需的仪器和用品： 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、可调式移液器、天平、低温离心机、 恒温水浴锅。 四、漆酶活性检测： 建议正式实验选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备 ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm，4℃离心 10min，取 上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 ② 细菌/细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细胞加入 1mL 提取液，冰 浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 ，间隔 7 ，总时间 3min）；12000rpm，4℃ 离心 10min，取上清置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 420nm，蒸馏水调零。 ② 在 1mL 玻璃比色皿中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 样本 120 试剂一 480 试剂二 200 25℃，立即于 420nm 处读取吸光值 A1， 反应 5min 后读取 A2，△A=A2-A1。 【注】若△A 差值较小，可增加样本量 V1（如由 120μL 增至 240μL，则试剂一相应减 少）或延长反应时间 T（如由 5min 增至 15min），则改变后的样本体积 V1 和本试剂盒仅供科研使用 2 反应时间 T 则代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1．按照蛋白浓度计算: 酶活定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位。 漆酶活性(nmol/min/mg prot)=[△A÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr)÷T=37.04×△A÷Cpr 2．按照样本质量计算: 酶活定义：每克样品每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位。 漆酶活性(nmol/min/g 鲜重)=[△A÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=37.04×△A÷W 3．按照细胞数量计算: 酶活定义：每 104个细胞每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位。 漆酶活性(nmol/min/104 cell)=[△A÷(ε×d)×V2×109]÷(细胞数量×V1÷V)÷T =37.04×△A÷细胞数量 4．按照液体体积计算: 酶活定义：每毫升液体每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位。 漆酶活性(nmol/min/mL)=[△A÷(ε×d)×V2×109]÷V1÷T=37.04×△A ε－－-ABTS 摩尔消光系数：36×103L/mol/cm； d－－-光径，1cm； V2－－-反应总体积，0.8mL=8×10-4L； V1－－-反应中样本体积，0.12mL； V－－-加入提取液体积，1mL； W－－-样本质量，g； T－－-反应时间，5min； Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 原创作者：上海瓦兰生物科技有限公司 |
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