| 本试剂盒仅供科研使用 谷氨酸脱羧酶（GAD）测定试剂盒说明书 （货号：WS2011F 分光法 24 样） 一、产品简介： 谷氨酸脱羧酶 (GAD，EC 4.1.1.15)是一种吡哆醛类裂解酶，能一的催化 L-谷氨酸 裂解成为 γ-氨基丁酸 (GABA)和 CO2。GAD 广泛分布于动植物和微生物中：哺乳动物 体内 GAD 催化产生的 GABA 是一种重要的抑制性神经递质；在植物中 GAD 的活性高 低可指示种子发芽能力和出苗率等。 本试剂盒利用苯酚和次氯酸钠比色法测定谷氨酸脱羧酶（GAD）催化产生的 GABA， 终生成蓝色物质，该物质在 645nm 处有明显光吸收，其颜色深浅与 GABA 含量呈正 比，进而得出 GAD 活力大小。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 30mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉体 mg×1 瓶 4℃保存 临用甩几下，使粉体落到底部， 再加入 6mL 试剂二溶解备用。 试剂二 液体 12mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 液体 20mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 液体 1.5mL×1 瓶 4℃保存 试剂五 液体 12mL×1 瓶 4℃保存 试剂六 A：液体 4.4mL×2 瓶 B：液体 5mL×1 瓶 4℃保存 临用 取 2.2mL 的 B 液进一瓶 A 液 中，混匀后作为试剂六使用。混匀 后的试剂半个月内用完。 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该标曲。 三、所需的仪器和用品： 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、水浴锅、离心机、可调式移液器。 四、谷氨酸脱羧酶（GAD）活性测定： 建议正式实验选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、 样本制备： ① 组织样本：取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心 10min， 取上清液待用。 ② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细 胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s， 重复 30 次）；12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 ③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。 2、 上机检测： ① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 645nm，蒸馏水调零。 ② 在 EP 管依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 100 100 试剂一 200 试剂二 200 混匀，40℃孵育 30min。本试剂盒仅供科研使用 2 试剂三 200 200 混匀，室温 12000rpm，离心 3min，上清液待测。 ③ 显色反应：在 EP 管中依次加入： 上清液 200 200 试剂三 125 125 试剂四 25 25 试剂五 200 200 试剂六 200 200 混匀，20℃放置 20min，取全部澄清上清液至 1mL 玻 璃比色皿（光径 1cm）中，于 645nm 处读取各管的 A 值，△A=A 对照-A 测定(每个样本需做一个自身对照)。 【注】若ΔA 值在零附近，可增加样本质量 W（如增至 0.2g），或延长 40℃孵育时间 T（如增 至 1h 或更长），或加大样本量 V1（如增至 300μL，则试剂三相应减少），则改变后的 W 和 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线：y = 2.0976x - 0.0059，x 为标准品摩尔质量(μmol)，y 为吸光值ΔA。 2、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克组织蛋白每分钟产生 1nmol 的 GABA 定义为一个酶活力单位。 GAD(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0059)÷2.0976]×(V2÷V3)÷(V1×Cpr)÷T×103 =397.3×(ΔA+0.0059)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 单位定义：每克组织每分钟产生 1nmol 的 GABA 定义为一个酶活力单位。 GAD(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0059)÷2.0976]×(V2÷V3)÷(W×V1÷V)÷T×103 =397.3×(ΔA+0.0059)÷W 4、按细胞数量计算： 单位定义：每 104个细胞每分钟产生 1nmol 的 GABA 定义为一个酶活力单位。 GAD(nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.0059)÷2.0976]×(V2÷V3)÷(500×V1÷V)÷T×103 =0.8×(△A+0.0059) 5、按照液体体积计算： 单位定义：每毫升液体每分钟产生 1nmol 的 GABA 定义为一个酶活力单位。 GAD(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0059)÷2.0976]×(V2÷V3)÷V1÷T=397.3×(ΔA+0.0059) V－－-提取液体积，1mL； V1－－-加入反应体系中样本体积，0.1mL； V2－－-反应体系总体积：0.5mL； V3－－-第②步显色阶段上清液量，0.2mL； T－－-反应时间，30min； W－－-样本质量，g； 标准品 GABA 分子量－－-103.12； 500－－-细胞数量，万； Cpr－－-样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 标准品母液（1mg/mL）：向 EP 管中加入 2mL 蒸馏水；把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.06, 0.12, 0.18, 0.24, 0.3 mg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。 2 按照显色反应阶段的测定管加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。 原创作者：上海瓦兰生物科技有限公司 |
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