| 本试剂盒仅供科研使用 脲酶（Urease，UE）测定试剂盒说明书 (货号：WS2140F 分光法 24 样) 一、产品简介： 脲酶（UE；EC 3.5.1.5）是一种含镍的寡聚酶，特异性地催化尿素水解释放出氨和二氧化碳。脲酶活性 与有机物质含量、全氮和速效氮含量呈正相关，反应了氮素状况。 本试剂盒利用靛酚蓝比色法测定脲酶水解尿素产生的 NH3-N，其在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚反 应，生成水溶性染料靛酚蓝，其深浅与溶液中的 NH3-N 含量呈正比，该物质在 578nm 有da光吸收，其 深浅与溶液中的 NH3-N 含量呈正比，进而得出脲酶活力大小。 二、测试盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60 mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 20mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂 g×1 瓶 4℃保存 用甩几下或 4℃离心使试剂落入试管底部，再加 入 3mL 蒸馏水，充分溶解，用不完的试剂 4℃保存。 试剂三 液体 13mL×1 瓶 4℃保存 避光保存。 试剂四 液体 7mL×1 瓶 4℃保存 试剂五 A：液体 7mL×2 瓶 B：液体μL×1 支 4℃保存 临用取 60μL 的 B 液进一瓶 A 液中，混匀后作为 试剂五使用。混匀后的试剂五一周内用完。 标准品 液体 1 mL×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品： 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、水浴锅、离心机、可调式移液器、研钵。 四、脲酶（UE）活性测定： 建议正式实验选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、 样本制备： ① 组织样本：称取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，冰浴 匀浆，12000rpm，4℃离心 10min，取上清液待用。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 ② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或 细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。 2、 上机检测： ① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 578nm，蒸馏水调零。 ② 在 EP 管依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本上清液 20 20 试剂一 190 190 试剂二 90 蒸馏水 90 混匀，放入 40℃水浴锅或恒温培养箱中孵育 1h ③ 显色反应：在 EP 管中依次加入：本试剂盒仅供科研使用 2 试剂名称（μL） 测定管 对照管 ②步反应混合液 60 60 蒸馏水 180 180 试剂三 240 240 试剂四 120 120 试剂五 240 240 充分混匀，37℃放置 20min 后，全部液体转移至 1mL 玻璃比 色皿（光径 1cm）中，于 578nm 处读取吸光值 A， ΔA=A 测定管-A 对照管（每个样本做一个自身对照）。 【注】1. 试剂三和四和五需分开加，不能事先混合。 2. 若ΔA 值较小，可增加取样质量 W（如 0.2g 或更多）或在②步中增加样本加样体积 V1（如增至 50μL，则试剂一相应减少），或在③步显色反应阶段增加上清液量 V2(如增至 100μL，则蒸馏水 体积相应减少)；则改变后的 W 和 V1 和 V2 需代入计算公式重新计算。 3. 若 A 测定值大于 1.8，可在③步阶段减少上清液量 V2(如减至 30μL，则蒸馏水体积相应增加)； 或用蒸馏水稀释③步检测用到的上清液，则改变后的 V2 和稀释倍数 D 需代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程为 y=1.0438x - 0.0015；x 为标准品质量（μg），y 为吸光值ΔA。 2、按样本蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟产生 1μg 的 NH3-N 定义为一个酶活力单位。 脲酶(UE)(μg/min/mg prot)=[(ΔA+0.0015)÷1.0438]×(V3÷V2)÷(V1×Cpr)÷T×D =4×(ΔA+0.0015)÷Cpr×D 3、按样本鲜重计算： 酶活定义：每克组织每分钟产生 1μg 的 NH3-N 定义为一个酶活力单位。 脲酶(UE)(μg/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0015)÷1.0438]×(V3÷V2)÷(W×V1÷V)÷T×D =4×(ΔA+0.0015)÷W×D 4、按细胞数量计算： 酶活定义：每 104个细胞每分钟产生 1μg 的 NH3-N 定义为一个酶活力单位。 脲酶(UE) (μg/min/104 cell)=[(ΔA+0.0015)÷1.0438]×(V3÷V2)÷(500×V1÷V)÷T×D =0.008×(ΔA+0.0015)×D 5、按液体体积计算: 酶活定义：每毫升液体每分钟产生 1μg 的 NH3-N 定义为一个酶活力单位。 脲酶(UE)(μg/min/mL)=[(ΔA+0.0015)÷1.0438]×(V3÷V2)÷V1÷T×D=4×(ΔA+0.0015)×D V－－-提取液体积，1mL； V1－－-②步反应体系中样本加样体积，0.02mL； V2－－-③步显色阶段上清液体积，0.06mL； V3－－-②步反应总体积，0.3mL； T－－-反应时间，60min；W－－-样本质量，g； 500－－-细胞数量； D－－-稀释倍数，未稀释即为 1； Cpr－－-样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1. 把标准品母液（1mg/mL），用蒸馏水稀释成以下浓度梯度的标准品：0,2,4,6,8,10. μg/mL。也可根据 实际样本来调整标准品浓度。 2. 在③步显色反应阶段，按照测定管加样表操作，依据结果即可制作标准曲线。 原创作者：上海瓦兰生物科技有限公司 |
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