l 本试剂盒用于体外定性检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人乳头状瘤病毒16型IgG抗体(HPV16 IgG Ab)。 l 有效期:6个月 l 保存条件:2-8℃ 实验原理 试剂盒采用间接法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被人乳头状瘤病毒16型IgG抗体(HPV16 IgG Ab)捕获抗原的包被微孔中,依次加入标本、阴性和阳性对照,再加入HRP标记的检测抗体,经过温育并彻di洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的人乳头状瘤病毒16型IgG抗体(HPV16 IgG Ab)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),判定阴阳性。 样本处理及要求 1. 血清:将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜,然后1000×g离心20 分钟,取上清即可,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。 2. 血浆:用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本,并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。 3. 组织匀浆:用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织,去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果),称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比,比如1g的组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融。zui后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟,取上清检测。 4. 细胞培养物上清或其它生物标本:请1000×g离心20分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。 注:标本溶血会影响zui后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。 需要而未提供的试剂和器材 1. 酶标仪(450nm) 2. 高精度加样器及枪头:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL 3. 37℃恒温箱 4. 蒸馏水或去离子水 试剂盒组成 名称 | 96孔配置 | 48孔配置 | 备注 | 微孔酶标板 | 96孔 | 48孔 | 无 | 阴性对照 | 0.3mL | 0.3mL | 无 | 阳性对照 | 0.3mL | 0.3mL | 无 | 样本稀释液 | 6mL | 3mL | 无 | 检测抗体-HRP | 10mL | 5mL | 无 | 20×洗涤缓冲液 | 25mL | 15mL | 按说明书进行稀释 | 底物A | 6mL | 3mL | 无 | 底物B | 6mL | 3mL | 无 | 终止液 | 6mL | 3mL | 无 | 封板膜 | 2张 | 2张 | 无 | 说明书 | 1份 | 1份 | 无 | 自封袋 | 1个 | 1个 | 无 | 注意事项 1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以bao证准确结果。所有试剂都必须在使用达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。 2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。 3. 消除板底残留的液体和手指印,否则影响OD值。 4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色,已经变蓝的底物液不能使用。 5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。 6. 在储存和温育时避免强光直接照射。 7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。 8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。 9. 不能使用过期产品。 10. 如果可能传播疾病,所有的样品都应管理好,按照规定的程序处理样品和检测装置。 试剂准备 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。 20×洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按1:20稀释,即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。 操作步骤 1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。 2. 设置阴性对照孔、阳性对照孔和样本孔,阴性、阳新对照孔各加50μL对照品,样本孔中加入待测样本50μL,空白孔不加。 3. 除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。 4. 弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液(350μL),静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。 5. 每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。 6. 每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。 实验结果计算 1. 阴性对照OD值:小于0.2。 2. 阳性对照OD值:大于0.8。 3、阳性判断(Cut-Off值):阴性对照OD值+0.25,样本OD值大于阈值,判定为阳性,反之,为阴性。 4、重复性:板内变异系数小于15%。 5、储藏:2-8℃避光密封保存。 原创作者:上海瓦兰生物科技有限公司 |